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2008年2月27日 (水)

Overlapping Fusion-PCR

慣れないベクターのコンストラクション中。

酵母の2μm ori とTEF1p-EM7p-ZeoR-CYC1TTのPCR産物をOverlapping Fusion-PCRで融合した。条件決めのために色々論文をあさってみたものの、” 私の条件では2つのフラグメントの重複はたかだか20bpなのでこの論文のは使えない”とか、” この実験のコンディションでこんなに大量のTemplateをぶち込んだらPCRの後で電気泳動したらバンドとして見えてしまうので、 ゲルから切り出さないといけないのでは?”という、イマイチなものばかりだったので、 結局Templateの希釈系列を作って条件決めをすることにした。

参考にした論文の条件の1/24-1/100位のテンプレート量でextra bandなしできれいに目的のPCR産物が取れることが分かった。やれやれ。

・・・というPCRの間に、職場の拡散防止措置の点検。第1弾は1時間半ほどかかった。もう、疲れました。

が、帰るまでに電気泳動でPCR産物の確認、形質転換と、PCRをもう1回。

明朝はPCR産物の電気泳動のゲルの準備、コロニーPCRの準備、deep well plateに培地を準備、 形質転換用の酵母の培養、etc.etc.

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